国家标准计划《消毒器械灭菌效果评价方法》由 361（国家卫生健康委）归口 ，主管部门为国家卫生健康委。

主要起草单位 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 、军事医学科学院疾病预防控制所 、江苏省疾病预防控制中心 、山东省疾病预防控制中心 、河南省疾病预防控制中心 、江西省卫生计生监督所 。

目前针对一些消毒灭菌器消毒灭菌效果评价方法还缺少相应的国标，该标准修订后主要内容将填补这方面的空缺。

本标准规定了压力蒸汽灭菌器（柜）、干热灭菌器（柜）、环氧乙烷灭菌器（柜）、低温蒸汽甲醛灭菌器（柜）和过氧化氢气体等离子体灭菌器（柜）灭菌效果鉴定试验的实验器材、实验步骤、评价规定以及注意事项。

本标准适用于压力蒸汽灭菌器（柜）、干热灭菌器（柜）、环氧乙烷灭菌器（柜）、低温蒸汽甲醛灭菌器（柜）和过氧化氢气体等离子体灭菌器（柜）灭菌效果的评价。

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4　消毒器械灭菌效果鉴定试验 4.1　压力蒸汽灭菌器（柜）灭菌效果鉴定试验 4.1.1　实验器材 4.1.1.1　试验菌片：嗜热脂肪杆菌芽孢（ATCC 7953或SSIK 31株）菌片（布片或滤纸片），回收菌量≥1×105CFU/片，在 121℃±0.5℃条件下，D值≥1.5min；也可用符合上述要求的自含式生物指示物。 4.1.1.2　标准生物测试包：23cm×23cm×15cm的普通棉布包（每10mm经线数30±6、纬线数27±5），质量1.5kg±3%。 4.1.1.3　通气贮物盒：体积为 22cm×13cm×6cm。 4.1.1.4　满载物品：使用说明书中规定的物品。 4.1.1.5　培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基(见附录A)；溴甲酚紫蛋白胨培养液(见附录A)。 4.1.1.6　恒温培养箱。 4.1.2　实验步骤 1) 将两个菌片装入灭菌小纸袋内（也可直接用生物指示物）； 2) 将装好菌片的纸袋或者两个嗜热脂肪杆菌（ATCC 7953或SSIK 31株）芽孢灭菌指示物置于标准测试包中心部位，制成标准生物测试包（也可使用一次性标准生物测试包）； 3) 对下排气压力蒸汽灭菌器（柜），将标准生物测试包分别放置于灭菌柜内中心部位、靠门处和排气口处，每处各放一包；对预真空式压力蒸汽灭菌器（柜），在灭菌器（柜）内每层各放置一个标准测试包；对器（柜）室容积较小，不能放入标准测试包的压力蒸汽灭菌器（柜）用通气贮物盒代替标准测试包，盒内盛满中试管，指示菌片或者灭菌指示物放于中心部位的两只灭菌试管内（试管口用灭菌牛皮纸包封），将贮物盒平放于压力蒸汽灭菌器（柜）底部； 4) 装入满载物品，满载运行1个灭菌周期。灭菌周期结束后，取出指示菌片，投入溴甲酚紫蛋白胨培养液中，或取出灭菌指示物，经56℃±1℃培养7d（灭菌指示物的培养方法按说明书执行），观察培养基颜色变化。检测时以培养基作为阴性对照，以加入指标菌片的培养基作为阳性对照。另取两片试验菌片进行回收菌量测定。灭菌指示物的阴性对照和阳性对照的设置方法按说明书操作； 5) 试验重复 5 次。 4.1.3　评价规定 4.1.3.1　每次试验阳性对照培养基颜色变黄，阴性对照培养基颜色不变，对照菌片的回收菌量≥1×105CFU/片；实验组颜色不变，判定为灭菌器（柜）灭菌效果合格。 4.1.3.2　用生物指示物进行评价时，结果判定按说明书进行。 4.1.4　注意事项 4.1.4.1　所用菌片和灭菌生物指示物须在有效期内使用。 4.1.4.2　严格遵守无菌操作技术规定。 4.1.4.3　试验应在满载条件下进行。 4.2　干热灭菌器（柜）灭菌效果鉴定试验 4.2.1　实验器材 4.2.1.1　枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢：实验室自用的枯草杆菌黑色变种芽孢悬液和芽孢菌片按《消毒技术规范》（2002年版）方法制备。菌片回收菌量为≥1×106CFU/片。在温度为160℃±2℃的条件下，D值≥2.5min。 4.2.1.2　染菌载体：以不锈钢片或玻片，面积为10mm×10mm，必要时增用或者改用其他载体。 4.2.1.3　胰蛋白胨大豆琼脂培养基(见附录A)；磷酸盐缓冲液(见附录A)；胰蛋白胨大豆肉汤培养基(见附录A)。 4.2.1.4　满载物品：可以装载物品的最高数量。 4.2.2　实验步骤 1) 每次试验取2个菌片为一组，平放于无菌平皿内，勿重叠。加盖，分别放于灭菌器（柜）内各层，对角线的内、中、外3点，相邻层对角线交叉摆放。在柜内摆放物品至满载； 2) 关闭器（柜）门，开启电源，按灭菌柜设计程序时间进行灭菌。灭菌完毕，取出平皿，将菌片取出接种于含5.0mL TSB试管中，置36℃±1℃恒温培养箱内培养7d，自第3日起每日观察结果，混浊表面有皱褶状菌膜者表示有菌生长，判定为阳性；澄清者表示无菌生长，判定为阴性。对难以判定的肉汤管，取其中0.2mL悬液接种TSA平板，用灭菌L棒涂布均匀，置 36℃±1℃ 恒温培养箱中培养。48h后涂片染色，在显微镜下观察菌落形态，或者进一步做其他试验，以判断生长者是否为试验菌。若有非试验菌污染，应当查找原因重新进行试验； 3) 菌数对照组，以同批试验用菌片2片放在室温下，待实验组灭菌接种后，立即分别移入含5.0mLPBS试管中，振打80次，按《消毒技术规范》（2002年版）所示方法进行活菌培养计数； 4) 阳性对照组，以同批试验用菌片2 片放在室温下，待实验组灭菌接种后，立即分别接种于 5.0mLTSB，放入培养箱中培养7d，自第3日起每日与实验组同时观察结果； 5) 阴性对照组，以未染菌载体2片分别接种于5.0mLTSB放入培养箱中作定性培养，观察有无细菌生长； 6) 试验重复5 次。 4.2.3　评价规定 4.2.3.1　在5次灭菌试验中，各次试验菌数对照