国家标准计划《化学品 急性眼刺激体外细胞试验 TRPV1活性检测法》由 TC251（全国危险化学品管理标准化技术委员会）归口，TC251SC1（全国危险化学品管理标准化技术委员会化学品毒性检测分会）执行 ，主管部门为国家标准委。

主要起草单位 南京市产品质量监督检验院等 。

随着我国工业化和现代化进程的全面推进，化学品在种类和数量上都有了极大丰富。

目前，我国已成为世界化学品的生产和使用大国。

化肥和农药产量分别位居世界第一和第二，使用量也居世界前两位。

同时，生产和使用化学品也给人体健康带来潜在危害与风险。

因此，化学品的风险评价与风险管理至关重要。

其中，眼刺激效应是化学品风险评价中不可缺少的环节。

眼睛是人类的视觉器官，具有复杂的结构，当化学物作用于眼前部时，就可能造成眼球及粘膜的损伤。

眼结膜是人体最脆弱的粘膜，含有丰富的微血管和毛细血管，角膜没有血管但含有丰富的神经，是痛觉和触觉最敏感的区域。

因此，可接触到眼的消费品，包括化妆品、日用洗化产品，药品等均需要进行眼刺激试验的安全性评价。

眼刺激性评价的重要性还体现于它是产品质量安全保障，质量控制和监督监管的核心。

比如化妆品研发企业可用于原料的筛选，不同配方间刺激性的比较等。

我国目前各项规范中采用的方法均基于兔眼刺激试验（Draize eye irritation test， Draize test）设计，它是一种经典的评价化学物眼刺激的动物试验方法，主要做法是将受试物作用于家兔结膜囊内，观察角膜、结膜、虹膜的变化，并进行评分，根据评分对受试物进行分级。

但是Draize 试验的缺点较为明显，评分存在主观性，动物实验外推到人的科学性存在争议，违背了目前减少动物试验的“3R”原则等。

因此，国内外已开始大力发展离体替代方法。

其中细胞水平试验是基于化学物产生的眼刺激作用与其损伤角膜、虹膜、结膜的炎症反应有关，结果客观，可定量，同时也避免了动物实验周期较长、耗时、动物与人的种属差异等缺点。

TRPV1是辣椒素的受体，主要分布于背根神经节和三叉神经节中的神经元。

伴随着三叉神经眼支的感觉神经纤维，TRPV1广泛分布在角膜、虹膜、结膜、泪腺等眼部结构。

在各种理化因素作用下，如温度，辣椒素等刺激物，pH等， TRPV1被激活，可引起Ca2+、Mg2+等离子内流，引起眼部刺激症状，在婴儿沐浴和洗发水产品中引起眼刺痛的洗发水组分，均可通过激动TRPV1受体引起眼刺激反应。

因此，通过对TRPV1的活性检测，可反映出受试物对眼刺激的效应及其强度。

本标准规定了化学品急性眼刺激的体外检测方法——TRPV1活性检测法。 主要技术内容： 1)试样制备: 固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至合适浓度；液体受试物可直接加入试验系统/或用前稀释至适合浓度。受试物在使用前必须新鲜配制，否则应证实储存不影响其稳定性。 溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活。首选溶剂是水或水溶性溶剂，二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，但使用时浓度不应大于0.5%。 受试物最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH的改变。应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况。应在预实验中确定细胞毒性和溶解度。 2)细胞培养及慢病毒感染： 扩增TRPV1，构建重组慢病毒载体，慢病毒包装并感染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，通过荧光定量PCR和western blot检测TRPV1的表达水平，确定转染效率。 3)细胞内Ca2+浓度检测： 应用高通量实时荧光检测分析系统FLIPR TETRA检测平台检测Ca2+浓度。Fluo-3/AM为Ca2+特异性荧光探针，阳性对照为辣椒素capsaicin。对比受试物与阳性参照辣椒素的荧光强度判断受试物对TRPV1的激活程度，同时利用抑制剂验证细胞内钙的增加是否是由于激动TRPV1引起。 我国各项规范中采用的方法均基于兔眼刺激试验（Draize eye irritation test， Draize test），出于动物福利考虑，世界上其他国家已提案或实施动物试验禁/限令。2013年3月，欧盟禁止销售采用动物做实验对象的化妆品。在此背景下，离体替代方法迅速发展。截止到2016年，经济合作与发展组织（OECD）验证并认可的测试方法有：牛角膜浑浊和渗透性试验（BCOP），离体鸡眼试验（ICE），荧光素漏出试验，短期暴露试验和重组人角膜上皮模型试验。尚待认可试验包括鸡胚绒毛膜尿囊膜试验（HET-CAM），绒毛膜尿囊膜血管试验（CAMVA），中性红摄取（NRU）和释放（NRR）试验，红细胞溶血试验（RBC）等。上述检测方法的观察终点只是整体反应的某一部分，未能解释眼刺激发生过程的机理，因此不同程度的出现了假阴性和假阳性，尚不能完全取代Draize试验。 随着国外发达国家和地区建立统一的化学品管理体系，并收集完整的原始数据，正建立一套基于安全风险评估的方法。从OECD认可的试验方法看，替代方法的发展方向是寻找一种单一完全替代试验，并能解释眼刺激屏障受损等一系列机制问题。能解释病理过程并有良好区分度的替代方法是未来完善的方向。一项关于蛋白质共价结合导致皮肤致敏的有害结局路径(adverse outcome pathway, AOP)于2016年得到OECD认可，并被REACH法规采纳。本标准拟采用的化学品急性眼刺激的体外检测方法——TRPV1活性检测法已被美国卫生毒理学研究所采用，对美国化学品眼刺激效应进行体外检测。