国家标准计划《蛋白检测 CRISPR Cas12a蛋白反式切割活性检测方法》由 TC387（全国生化检测标准化技术委员会）归口 ，主管部门为国家标准委。

主要起草单位 深圳市第二人民医院 、无锡吐露港生物医药科技有限公司 、中国测试技术研究院生物研究所等 。

CRISPR-Cas系统是细菌和古生菌等原核生物具有的一套专门针对噬菌体或外源性遗传物质的免疫系统。

CRISPR技术具有高度可编程性和灵活性，在科研、育种和疾病治疗方面具有重要的用途，最早应用该技术的两位美国教授也因此获得了2020年诺贝尔化学奖。

当前CRISPR技术不仅被用于基因编辑、基因转录调控、表观遗传修饰和基因组成像，而且还可以应用于分子诊断。

据Future Market Insights的分析，CRISPR Cas的基因全球市场规模在2021年达到18亿美元，并以超30 %的复合增长率增长，亚太地区是全球增长最快的地区。

必要性：具有酶活性的蛋白通常以活性单位浓度来标识蛋白的浓度，以便于确定酶促反应的用量，如聚合酶活性单位浓度通常为5 U/μL，核酸酶活性单位浓度为1 U/μL。

然而对于Cas12a蛋白，由于缺乏统一的反式切割单位(Trans U)，目前国内外厂家，例如NEB、百普赛斯、金斯瑞、吐露港、东抗生物等几乎所有在售的产品，仍然以质量浓度或摩尔浓度来标识蛋白浓度，因而对于应用Cas12a蛋白的酶活性来进行核酸检测，其准确用量难以推导，造成检测结果往往存在较大偏差。

这无疑将限制CRISPR-Cas检测技术的应用范围。

因此，亟需制定CRISPR Cas12a蛋白反式切割活性检测方法和定义CRISPR Cas12a反式切割单位的国家标准，以规范CRISPR-Cas检测技术。

其次，目前中外CRISPR检测技术公司不相伯仲，基本处于同一起跑线，当前市场上还未形成绝对垄断的CRISPR-Cas通用型检测技术和产品。

在此关键发展时期，我们既需要在技术标准层面上不断优化CRISPR检测技术的便捷检测方法，在技术原研创新中抢占技术专利优势，也需要在市场产品层面加大产品应用的范围，反过来不断促进技术的发展与进步。

可喜的是，在CRISPR-Cas检测技术领域，以吐露港为代表的一批中国企业，站在了国际前沿水平上，可与国外企业一较高下。

因此，为抢占国际市场上CRISPR-Cas检测技术的商业化和产业化的制高点，亟需制定CRISPR Cas12a蛋白反式切割活性检测方法的国家标准，以提高CRISPR-Cas的全链条产业。

另外，与传统基于PCR原理的检测技术相比，CRISPR-Cas检测技术在检测的灵敏度、特异性、简便性和产品便携性等方面显示出巨大的优势，已成为下一代核酸检测技术，广泛用于现有核酸检测的几乎所有领域，例如，寨卡病毒、登革病毒、艾滋病毒、HPV的检测与分型、DMDX（杜氏肌营养不良症）病人的检测、抗生素抗性的检测、肿瘤病人及用药相关的SNP、甲基化及microRNA的检测等等。

新冠疫情期间，美国FDA和我国药监局批准了基于CRISPR技术的新冠病毒检测试剂盒的上市。

因此，亟需制定CRISPR Cas12a蛋白反式切割活性检测方法，助力快速核酸检测技术向更灵敏便捷的方向发展，以满足人口老龄化后，日益增长的“早发现、早诊断、早治疗”的需求以及新发传染病的低成本、快速检测需求。

可行性： 3.1 相关技术成熟 在Cas12a蛋白的制备方面，已有多个团队建成了“质粒构建-蛋白酶诱导表达-蛋白酶纯化-蛋白酶活性验证”全链条的成熟技术，能够保证制备高纯度和高活性的蛋白酶。

在缓冲液方面，也有团队建立了成熟的缓冲液组分优化技术，如我们团队优化的10× HOLMES缓冲液为目前Cas12a进行反式切割的最佳缓冲体系。

因此基于目前已经成熟的相关技术，能够保证本项目的顺利完成和减少项目的经济成本。

3.2 研究基础扎实 在研究基础方面，本团队系首次发现CRISPR-Cas12a蛋白具有反式切割活性，并利用该活性开发了HOLMES及HOLMESv2靶标核酸快速检测方法，并且进一步定义了Cas12a的反式切割活性，因此该Cas12a反式切割活性检测方法可推荐作为Cas12a反式切割活性的国家标准检测方法。

3.3 研究团队和平台有保障 深圳市第二人民医院承担了973、863、国际合作、重点研发等国家级重大课题16项。

在自然指数排行榜中，医院进入全国百强，2020年ESI排名，医院临床医学学科进入全球机构前1 %，并且参与制定了3项国家标准的发布实施和3项地方标准的发布实施。

同时依托深圳市第二人民医院，建有深圳市医学检验分子诊断学重点实验室、深圳重大疾病体外诊断公共技术服务平台，并与迈瑞共建了检验医学创新与标准化联合实验室。

本项目共同上报单位无锡吐露港生物医药科技有限公司为一家致力于为体外诊断提供完美解决方案的创新型公司，在CRISPR诊断方面有多年的积累。

另外，本项目团队的其他负责人长期从事生物医学检测及其技术的研发与标准化工作，在理论、技术和资源各方面均有深厚的积累，能够保障本项目的顺利开展。

1、范围 本文件描述了CRISPR Cas12a蛋白反式切割活性检测方法的原理、试剂或材料、仪器设备、试剂样品制备、实验步骤和数据处理。 本文件适用于CRISPR Cas12a蛋白反式切割活性的检测。 2、主要技术内容 本文件的主要技术内容包括： （1）术语与定义：对CRISPR、Cas12a蛋白、crRNA、Cas12a蛋白反式切割活性、Cas12a蛋白反式切割单位进行了定义； （2）测定Cas12a蛋白反式切割活性的试验原理； （3）测定Cas12a蛋白反式切割活性所用到的主要仪器； （4）测定Cas12a蛋白反式切割活性所用到的主要试剂； （5）测定Cas12a蛋白反式切割活性的主要实验步骤：包括试剂稀释、切割标准曲线试验、不切割标准曲线试验、活性测定试验。 （6）数据处理：包括切割标准曲线制作、不切割标准曲线制作以及基于两个标准曲线的酶活性单位计算